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地特四等申論題 105年 [衛生技術] 生物技術學概要

第 一 題

📖 題組:
SDS-PAGE 常用來分離蛋白質,並決定其分子量,請敘述此實驗製備過程中各個化合物的功用:(每小題 3 分,共 15 分) (一) SDS (二) Ammonium persulfate (三) TEMED (四) Glycine (五) Bis-acrylamide
📝 此題為申論題,共 5 小題

小題 (一)

SDS

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看到 SDS-PAGE 中的 SDS,首先要想到它是一種強效的陰離子界面活性劑。答題時務必寫出它的兩大核心作用:「使蛋白質變性(破壞立體結構使其線性化)」以及「賦予蛋白質均勻的負電荷」,進而讓蛋白質在電泳時僅以分子量大小作為分離依據。

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SDS(十二烷基硫酸鈉,Sodium Dodecyl Sulfate)為一種陰離子界面活性劑,在 SDS-PAGE 中的主要功用包含: (1) 使蛋白質變性:破壞蛋白質分子內的非共價鍵(如氫鍵、疏水性交互作用等),使其失去原有的二、三級立體結構,展開成線性的多肽鏈。 (2) 賦予均勻負電荷:SDS 能以固定的質量比例(約 1.4 g SDS / 1 g 蛋白質)結合在變性的多肽鏈上,使其帶有大量且均勻的負電荷,從而掩蓋蛋白質原本的電荷差異。

小題 (二)

Ammonium persulfate

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看到 Ammonium persulfate (APS),應立刻聯想其在「凝膠聚合反應」中扮演的「起始劑」角色。答題時需點出它能產生自由基,並引發 acrylamide 單體進行聚合反應的機制。

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Ammonium persulfate (APS) 在膠體配製過程中作為自由基起始劑(initiator)。 其主要功用是在 TEMED 的催化下,解離產生硫酸根自由基(sulfate free radicals)。這些自由基會進一步攻擊丙烯醯胺(acrylamide)單體,從而引發單體與交聯劑(bis-acrylamide)之間的連鎖聚合反應(polymerization),最終凝固形成聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)。

小題 (三)

TEMED

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看到 TEMED,應立刻聯想到它與 APS(過硫酸銨)在凝膠聚合反應中的搭配關係。作答時需明確點出其「催化劑」的角色,並說明它如何促使自由基產生進而引發聚合反應。

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TEMED(四甲基乙二胺)在製備過程中扮演催化劑的角色。其主要功用是催化過硫酸銨(Ammonium persulfate, APS)加速產生自由基(free radicals)。這些自由基隨後會引發丙烯醯胺(Acrylamide)單體與雙丙烯醯胺(Bis-acrylamide)進行聚合與交聯反應,進而促使聚丙烯醯胺凝膠(Polyacrylamide gel)快速凝固成型。

小題 (四)

Glycine

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看到 Glycine 應聯想到不連續電泳系統的緩衝液成分。解題關鍵在於指出它作為「尾隨離子(Trailing ion)」,利用兩性胺基酸在不同 pH 值下的帶電特性,在濃縮膠中協助蛋白質產生「濃縮效應(Stacking effect)」。

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Glycine(甘胺酸)主要存在於電泳緩衝液(Running buffer)中,其主要功用如下:

  1. 作為尾隨離子(Trailing ion):在不連續凝膠電泳系統中,與前導離子(通常為凝膠中的氯離子 Cl⁻)互相配合。
  2. 促成濃縮效應(Stacking effect):Glycine 為兩性胺基酸,在濃縮膠(pH 6.8)中大部分呈電中性,僅帶微弱負電,電泳遷移率極慢;而氯離子遷移率極快。兩者之間會形成高電壓梯度(陡峭的電場)。

小題 (五)

Bis-acrylamide

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看到「Bis-acrylamide」,應聯想其在聚丙烯醯胺凝膠(PAGE)製備中的結構角色。它是一種交聯劑,能將線性的丙烯醯胺聚合物連接成三維網狀結構,進而決定膠體的孔隙大小。

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「Bis-acrylamide(雙丙烯醯胺)」在 SDS-PAGE 中主要作為交聯劑(Cross-linker)。 其功用為與 Acrylamide(丙烯醯胺)單體在聚合反應中形成交聯,使線性的聚丙烯醯胺鏈互相連結,形成立體的三維網狀結構膠體。透過調整 Bis-acrylamide 與 Acrylamide 的濃度與比例,即可精確控制膠體孔隙的大小,進而決定對不同分子量蛋白質的分離效果與解析度。

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